کلونینگ، بیان خارج سلولی،تخلیص و تعیین خصوصیات استیل کولین استراز دروزوفیلا ملان.گاستر جهش یافته در پیکیا پاستوریس

مقدمه: استیل کولین استراز یکی از مهمترین آنزیم های سیستم عصبی مرکزی است که در فضای سیناپسی استیل کولین را هیدرولیز کرده باعث خاتمه پیام عصبی می شود. این آنزیم هدف برخی از قدرتمندترین سم ها قرار می گیرد و غیر فعال شدن آن می تواند برای سلامتی انسان خطر آفرین باشد. برای تشخیص این گونه سموم در محیط یا مواد غذایی، استیل کولین استراز می تواند در ساخت زیست گرها مورد استفاده قرار گیرد. برای این منظور، استیل کولین استرازهایی با پایداری بالا مورد نیاز است. روش تحقیق: به منظور افزایش پایداری ایجاد یک پیوند دی سولفید جدید در ساختار استیل کولین استراز دروزوفیلا ملانوگاستر، در توالی این آنزیم اسید آمینه های ایزولوسین 298 و آسپارتیک اسید 346، با اسید آمینه سیستئین جایگزین گردیدند. هر دو توالی طبیعی و جهش یافته بر اساس ترجیح کدونی این مخمر پیکیا پاستوریس طراحی و سنتز شدند. ژن های سنتز شده در مخمر پیکیا پاستوریس کلون و بیان شدند و پس از تخلیص با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی، پارامترهای سینتیکی و پایداری این دو آنزیم در دماهای مختلف و در برابر عوامل دناتوره کننده سنجیده شد. یافته ها: نیمه عمر آنزیم طبیعی بیان شده در مخمر در دمای 50 درجه سانتی گراد و در برابر اوره 4 مولار به ترتیب 11/9 و 5 برابر آنزیم طبیعی بیان شده در سلولهای sf9 است. نیمه عمر آنزیم جهش یافته بیان شده در مخمر در دمای 50 درجه سانتی گراد و در برابر استونیتریل % 20 و اوره 4 مولار به ترتیب 51/5 ، 76/2 و 4/1 برابر بیشتر از آنزیم جهش یافته بیان شده در سلول های sf9 می باشد نیمه عمر آنزیم جهش یافته بیان شده در مخمر نسبت به آنزیم طبیعی بیان شده در مخمر دمای60، 55،50 و 45 درجه سانتی گراد و در برابر استونیتریل % 20 و اوره 4 مولار به ترتیب 8/2، 93/1078،70/85، 75/1، 27/6 و 66/2 برابر بیشتر می باشد. نتیجه گیری: بیان آنزیم استیل کولین استراز دروزوفیلاملانوگاستر در مخمر پیکیا پاستوریس باعث افزایش پایداری این آنزیم می شود. به علاوه ایجاد جهش برای تشکیل باند دی سولفیدی c298-c346 نیز پایداری آنزیم را افزایش می دهد.